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《中國藥典》2015年版,通則9204 微生物鑒定指導原則

更新日期:2019-10-10 13:43:36 點擊率:

《中國藥典》2015年版,通則9204 微生物鑒定指導原則


本指導原則為非無菌產品微生物限度控制菌檢查中疑似菌的鑒定, 以及藥物原料、輔料、制藥用水、中間體、終產品和環境中檢出微生物的鑒定提供指導。當微生物的鑒定結果有爭議時, 以《伯杰氏系統細菌學手冊》 (Bergey, s Manualof Systematic Bacteriology)現行版的鑒定結果為準。

微生物鑒定是指借助現有的分類系統,通過對未知微生物的特征測定,對其進行細菌、酵母菌和霉菌大類的區分,或屬、種及菌株水平確定的過程,它是藥品微生物檢驗中的重要環節, 藥典通則相應章節中對檢出微生物的鑒定做了明確規定,如非無菌藥品的微生物檢查:控制菌檢查(通則 1106)中選擇培養基或指示培養基上發現的疑似菌落需進行鑒定; 對無菌檢查法(通則 1101)的陽性實驗結果中分離的微生物進行鑒定,以判定試驗是否重試;藥品潔凈實驗室微生物監測和控制指導原則(通則 9203)中建議對潔凈室和其他受控環境分離到的微生物進行鑒定,以掌握環境微生物污染情況,有助于污染調查。此外,在藥品生產中,有時亦需對藥物原料、輔料、制藥用水、生產環境、中間產物和終產品中檢出的微生物進行適當水平的鑒定。

微生物鑒定需達到的水平視情況而定,包括種、屬鑒定和菌株分型。大多數非無菌藥品生產過程和部分無菌生產環境的風險評估中, 對所檢出微生物的常規特征包括菌落形態學、細胞形態學(桿狀、球狀、細胞群、孢子形成模式等)、革蘭染色或其它染色法、及某些能夠給出鑒定結論的關鍵生化反應(如氧化酶、過氧化氫酶和凝固酶反應)進行分析,一般即可滿足需要; 非無菌產品的控制菌檢查一般應達到種屬的水平;無菌試驗結果陽性和無菌生產模擬工藝(如培養基灌裝)失敗時,對檢出的微生物鑒定至少達到種屬水平,必要時需達到菌株水平。

一、微生物的鑒定程序

微生物鑒定的基本程序包括分離純化和鑒定,鑒定時,一般先將待檢菌進行初步的分類。鑒定的方法有表型微生物鑒定和基因型微生物鑒定,根據所需達到的鑒定水平選擇鑒定方法。微生物鑒定系統是基于不同的分析方法,其局限性與方法和數據庫的局限性息息相關, 未知菌鑒定時通過與微生物鑒定系統中的標準微生物(模式菌株)的特征(基因型和/或表型)相匹配來完成。如果數據庫中沒有此模式菌株,就無法獲得正確的鑒定結果。在日常的微生物鑒定試驗中,用戶應明確所采用鑒定系統的局限性及所要達到的鑒定水平(屬、種、菌株),選用最適合要求的鑒定技術,必要時采用多種鑒定方法確定。

1、待檢菌的分離純化

微生物鑒定的第一步是待檢培養物的分離純化, 最常用的分離純化方法是挑取待檢菌在適宜的固體培養基上連續劃線分離純化,以獲取待檢菌的純培養物(單個菌落)必要時可進一步進行純培養,為表型鑒定和隨后的鑒定程序提供足夠量菌體。從藥物原材料、制藥用水、及生產環境、中間產物和終產品的樣品中檢出的受損微生物, 經分離純化程序使其由不利生存易產生變化的狀態轉變為在營養富集和最佳培養溫度條件下生存的穩定狀態,以保證鑒定結果準確性。

2、初篩試驗

常規的微生物鑒定,一般要先進行初篩試驗確定待檢菌的基本微生物特征,將待檢菌做初步分類。常見的初篩試驗包括革蘭染色、芽孢染色、鏡檢觀察染色結果和細胞形態、重要的生化反應等。

重要的生化篩選試驗包括:

氧化酶試驗用于區分不發酵的革蘭陰性桿菌(氧化酶陽性)和腸道菌(氧化酶陰性)。

過氧化氫酶試驗用于區分葡萄球菌(過氧化氫酶陽性)和鏈球菌(過氧化氫酶陰性)。

凝固酶試驗用于區分凝固酶陰性葡萄球菌 (可推測為非致病性)和凝固酶陽性葡萄球菌(很可能為致病性)。

初篩試驗可為評估提供有價值的信息,對于微生物鑒定方法來說,初篩試驗是最關鍵的一步,若給出了錯誤的結果,將影響后續試驗,包括微生物鑒定試劑盒和引物的選用。

3、表型微生物鑒定

表型微生物鑒定依據表型特征的表達來區分不同微生物間的差異, 是經典的微生物分類鑒定法,以微生物細胞的形態和習性表型為主要指標,通過比較微生物的菌落形態、理化特征和特征化學成分與典型微生物的差異的進行鑒別。微生物分類中使用的表型特征見表 1。

1 微生物分類中使用的表型特征

分類

特征

培養物

菌落形態、菌落顏色、形狀、大小和產色素

形態學

細胞形態、細胞大小、細胞形狀、鞭毛類型、內容物、革蘭氏
染色、芽孢和抗酸染色、孢子形成模式

生理學

氧氣耐受性、pH 范圍、最適溫度和范圍、耐鹽性

生化反應

碳源的利用、碳水化合物的氧化或發酵、酶的模式

抑制性

膽鹽耐受性、抗生素敏感性、染料耐受性

血清學

凝集反應、熒光抗體

化學分類

脂肪酸構成、微生物毒素、全細胞組分

生態學

微生物來源

微生物細胞的大小和形態、芽孢、細胞成分、表面抗原、生化反應和對抗菌劑的敏感性等表型的表達,除受其遺傳基因的控制外,還與微生物的分離環境、培養基和生長條件等因素有關。表型微生物鑒定通常需要大量的純培養物,而微生物的恢復、增殖和鑒定易受培養時間影響,事實上許多環境微生物在普通的微生物增殖培養基中是無法恢復的;此外,一些從初始培養物中剛分離出的受損微生物還可能不能完整的表達其表型屬性。因此,在表型鑒定時應注意采用的培養基、培養時間和傳代次數對鑒定結果的影響。目前已有的基于碳源利用和生化反應特征的鑒定方法,如氣相色譜法分析微生物的脂肪酸特征、 MALDI-TOF 質譜法分析微生物蛋白等微生物鑒定系統, 在進行結果判斷時需借助于系統自身的鑒別數據庫,還依賴特定的培養基和培養方法以確保鑒定結果的一致性。

表型微生物鑒定方法已廣泛應用于藥品微生物實驗室。根據微生物表型鑒定所提供的信息可以判斷藥品中污染的微生物種類, 也可掌握環境微生物菌群的變化,并進行產品的風險評估。在許多質量控制調查中,單獨的表型鑒定結果就能給出充足的信息幫助調查人員進行深入調查,并按需要制定適宜的糾正措施。

4、基因型微生物鑒定

與表型特征不同,微生物基因型通常不受生長培養基或分離物活性的影響,只需分離到純菌落便可用于分析。由于大部分微生物物種中核酸序列是高度保守的,所以 DNA–DNA 雜交、聚合酶鏈反應、16S rRNA 序列和 18S rRNA 序列、多位點序列分型、焦磷酸測序、DNA 探針和核糖體分型分析等基因型微生物鑒定方法理論上更值得信賴?;蜩b定法不但技術水平需要保證,還需要昂貴的分析設備和材料,通常僅在關鍵微生物調查中使用,如產品不合格調查。若使用,方法必須經過確認。

目前《伯杰氏系統細菌學手冊》中對細菌分類的描述是通過遺傳物質的分析比較來實現的。通過未知微生物的 DNA 與已知微生物的 DNA 比較,能夠確定親緣關系的遠近?;蛐偷蔫b定可通過 DNA 雜交、限制性酶切片段圖譜的比較和/DNA 探針完成, 若 DNA–DNA 的雜交親緣關系大于 70%時, 表明微生物是同一種屬;表 2 系統發育典型的分析方法是通過比較細菌 16S rRNA 或真菌 18S rRNA 基因的部分堿基序列來實現,即經過聚合酶鏈反應(PCR)進行基因擴增、電泳分離擴增產物、以雙脫氧鏈終止法進行堿基測序,然后與經驗證過的專用數據庫或利用公共的數據庫(不一定經過驗證)進行比對。

2 微生物分類學的基因型/系統發育的特征

類別

特征

基因型

DNA-DNA 雜交、DNA 堿基比例 ( G + C)、限制性酶切片段圖
譜和 DNA 探針

系統發育結構

16S rRNA 序列和 18S rRNA 序列

基于核酸的方法可以用來篩選處于過渡期受損的微生物。 將存在于過渡期與菌株生存能力相關的 rRNA,通過逆轉錄的方法轉換為可用于 PCR 擴增的 DNA。解決了不能存活的細菌細胞中 DNA 的擴增問題。該方法經過樣品收集、核酸提取、目的片段擴增、雜交和檢測等步驟,涉及了變異微生物的檢測、檢測限、基質效應、正向截點的核查、儀器設備和系統攜帶污染、分析的精確性和試驗的重現性等內容。

rRNAs 記錄了微生物的進化歷史,對這些序列進行分析可以對微生物進行系統分類和鑒定。

二、 微生物鑒定方法的確認

微生物鑒定系統的確認試驗按下述方法之一進行: (1) 采用現有方法和待確認方法對日常檢驗中分離的微生物約 50 株進行平行鑒定試驗,鑒定結果的差異可使用仲裁方法判定。(2)使用 12~15 種已知的能代表常規分離到的微生物的儲備菌種,共進行 50 次鑒定試驗。(3)待確認方法對 20~50 株微生物(包括 15~20個不同的種)進行鑒定,結果應與參照實驗室的鑒定結果一致。確認試驗所用的菌株應包括鑒定方法供應商和藥典推薦的適宜質控菌株。

對所用的微生物鑒定系統的鑒定結果應進行評估, 同時還應考慮其一致性水平,合適的微生物鑒定系統,試驗菌株與模式微生物的一致性水平通常應大于90%。若可能,微生物鑒定方法確認所用的挑戰微生物應包括非發酵型細菌、棒狀桿菌和凝固酶陰性的葡萄球菌等,但其一致性水平可能比較低。

微生物鑒定系統不能鑒定所有的微生物,因為數據庫中未包含此微生物,或系統參數無法充分識別該微生物,或該微生物在系統中無反應、或該微生物尚未被分類描述。錯誤鑒定結果確認是比較難的,任何微生物鑒定都應從微生物形態學、生理要求和微生物來源等方面判斷鑒定結果是否合理。錯誤的鑒定會導致不恰當的糾正和預防措施及產品處置。

微生物鑒定方法的確認應包括準確度、專屬性、重現性、靈敏度、陽性預測值、陰性預測值。

確認試驗最重要的是準確性和重現性。這些測量值按下述定義:

準確性% =(結果正確的數量/總的結果數量)× 100

重現性% =(結果正確且達到一致性的數量/總的結果數量)× 100

用戶應該考慮鑒定方法的適用性,建立準確性和重現性的接受標準。

其它測定值如靈敏性、專屬性、陽性或陰性預測值。通過以下例子能很好的說明這些測定值。例,臨床微生物實驗室,分別用 DNA 雜交探針和傳統培養物方法處理了 100 個臨床樣本,前者陽性結果比后者高 10%,結果列于表 3。

3 DNA 探針和培養物方法的陰陽性結果分布對照

    培養方法結果

    陽性    陰性

DNA探針結果 陽性    9   2

            陰性    1   88

準確度=(9+88)/100 × 100 = 97%

靈敏度=[9/(9 + 1)] × 100 = 90%

專屬性=[88/(88 + 2)] × 100 = 97.7%

陽性預測值(PPV= [9/(9 + 2)] × 100 = 81.8%

陰性預測值(NPV= [88/(88 + 1)] × 100 = 98.9%

應注意到試驗的陽性預測值不是固定的, 它取決于臨床樣本中微生物的普遍程度。陽性預測值與流行疾病和條件成正比。如果在一組人群試驗中感染人數比例較高,則陽性預測值較高,陰性預測值較低。如果組中所有人都被感染,則陽性預測值為 100%,陰性預測值為 0%。這些函數引出的數字列于表 4 中。

4 關于培養物方法和替代方法 PCR 法的兩行兩列表

聚合酶鏈反應

培養方法

陽性

陰性

總數

陽性

a 真陽性

b 假陰性

a + b

陰性

C 假陽性

d 真陰性

c + d

總數

a + c

b + d

包容性(靈敏度) (%) = [a/(a + b)] × 100

排除性(專屬性) (%) = [d/(c + d)] × 100

陽性預測值 (%) = [a/(a + c)] × 100

陰性預測值 (%) = [d/(b + d)] × 100

分析準確度 (%) = [(a + d)/(a + b + c + d)] × 100

Kappa Index 系數 = 2(ad bc)/[(a + c) × (c + d) + (a + b) × (b +

d)]

三、系統發育的相關內容

《伯杰氏系統細菌學手冊》(第二版)內容是依據核糖體小亞基 16S RNA的核苷酸序列分析按照系統發育為框架編寫的,而不是按照表型結構編寫的。

系統發育樹或樹狀圖顯示了遺傳關系最接近的微生物, 這項技術的應用導致了分類的修正和一些已知微生物的重命名, 如真菌黑曲霉 ATCC16404 被重名為巴西曲霉。一般而言,微生物親緣關系小于或等于 97%被認定為不同的屬,那些親緣關系小于或等于 99%被認定為不同的種,但是這種普遍性有很多的例外情況。

基因型鑒定與表型鑒定的結果差異的情況相對比較少見,例如,具有相同或非常相似基因的微生物具有不同的表型、 具有相似表型的卻具有不同的基因以及基因型距離很遠的微生物不能被歸為同種或同屬。多相分類學的概念是匯集和吸收了分子生物學、生理學、形態學、血清學或生態學資源的多層信息進行微生物分類,例如,微生物特征描述、表型和基因數據及微生物來源等,都可被成功的應用于微生物鑒定中,以避免因使用單一鑒定方法做出毫無意義的結論。

四、 溯源分析

菌株水平的鑒定在污染調查過程中非常重要, 尤其適用于產品中的微生物數量高于建議水平或出現異常高的微生物檢出情況時。菌株水平的鑒定在無菌工藝中也很重要,在無菌試驗結果陽性和培養基灌裝等模擬工藝失敗時,必須對檢出的微生物進行評估。同一地點的同種菌其表型特征和基因型特征是基本一致的。不同地點的同種菌表型特征可能基本一致, 但保守及可變區域的基因特征會有一定的差異性。因此污染調查等應以基因型特征鑒定為主,表型特征鑒定為輔。

細菌 16S rDNA 和真菌的 18S rDNA 為各自的保守序列區域,對種水平的鑒定是非常有用的,但不足以區分親緣關系近的不同種或同種中的不同株。與此相反,限制性核酸內切酶進行酶解的 Southern 雜交是能有效地顯示兩個株之間的差異 。如果帶型表現的完全相同則僅能說明限制性核酸內切酶在兩株菌基因組的那個區域具有相似的酶切位點, 要證明兩株菌是同一株時應該包括兩個或更多不同限制性核酸內切酶的酶解物,每個內切酶都可得到一定的 DNA 區域的譜帶,所有來自兩株菌的譜帶都必須完全一致。如脈沖場電泳等,就是利用此原理進行菌株區分的。

實際工作中無菌試驗陽性結果中分離出的微生物,經對其溯源分析,確認污染歸因于無菌試驗過程中所使用的材料或無菌技術的差錯,該試驗可判無效,否則判該產品不符合要求。對潔凈室和其他受控環境分離到的微生物進行適當比率的鑒定,掌握環境微生物污染情況,有助于污染調查。

為了確證微生物為同種中的兩個相同株,需比對更多的基因序列和特征基因片段,甚至是全基因的比對,實現既鑒定又溯源的目的,同時保證結果的準確性。 此外,有些微生物的溯源還需結合表型特征鑒定,如沙門菌屬(血清型的鑒定)。


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